【EPA1623方法的操作簡介】

“EPA1623方法”是由美國國家環保局指定的用于測定水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的標準方法。概況地說，該方法分為三部。第一，水樣進行過濾收集水中的亂囊和孢囊；第二，利用免疫磁分離來純化過濾樣品；第三，對純化的樣品通過免疫熒光顯微鏡法來監測“兩蟲”的數量。

1、水樣過濾

采用美國EPA推薦的PALL公司Envirochek-HV囊式濾器對水過濾，將卵囊、孢囊及其他無知收集在過濾器上。該過濾器可用于實驗室批量水樣的過濾，也可以用于野外現場水樣的過濾。過濾后的囊式濾器，用洗脫劑將攔截在濾囊上的顆粒物震蕩洗脫下來，并將洗脫物收集在一個250毫升的離心管中。

   Life Sciences

  ◇兩蟲檢測囊式過濾器:水樣過濾采用圖2所示的方法將PALL公司囊式濾器（見圖3）安裝好，過濾器的濾囊用圖4所示的震蕩器進行洗脫分離。

  ◇特點

• EPA1622＆1623方法推薦首選產品。

• 1um孔徑的改良濾膜能100%截留兩蟲。

• 一次性使用的設計避免了因其他因素的污染而造成的實驗結果誤差。

• 專用于源水與自來水的隱孢子蟲與賈第鞭毛蟲的濃縮與回收，使用簡單、方便、快捷。

 2、免疫磁分離  
   離心管中的洗脫物通過離心分離作用，使顆粒物沉淀在離心管底部，同時去掉離心管中的上清液。將離心后的含有卵囊和孢囊的沉淀物用純水混勻，并向其中加入Dynal公司的免疫磁分離試劑（Dynabeads GC-Combo試劑盒）進行磁分離。具體做法是：首先用帶有抗體（抗隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲）的特殊磁珠捕獲沉淀物的卵囊和孢囊；其次通過Dynal公司的MPC-S磁粒濃縮器將捕獲有卵囊和孢囊的磁珠吸附在試管壁上，去掉未被吸附在試管壁上含雜質的液體，以達到卵囊和孢囊從沉淀物中分離出來的目的；再次加入鹽酸將管壁上捕獲有卵囊和孢囊的磁珠進行洗滌，以使卵囊和孢囊從磁珠上解離出來；最后將含有卵囊和孢囊的純化液轉移至井形載玻片上進行制片。

   ◇隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的純化—免疫磁分離技術:1999年美國環保局在EPA1623方法中規定利用IMS{Immuo Magnetic Separation}免疫磁分離技術Dynabeads來分選檢測飲用水中隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊，其原理是：利用帶有特異性抗體的磁珠與樣品中的目標產物G/C特異性抗原相結合，在磁場中搞笑選擇中分離。
   3、IFA染色&鏡檢
   待井形載玻片的純化液干后，用NaOH中和井形載玻片上樣品，再用Dynal公司的Aqua-GloTMG/C染色試劑盒，將卵囊和孢囊在井形載玻片上用磁熒光標記的單性抗體和DAPI溶液著色后，蓋上蓋玻片。然后，OLYMPUS熒光和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡對著色樣本進行檢測。觀察樣本，對符合卵囊和孢囊大小、外形、熒光特性的對象進行定性、定量分析。
   ◇研究型正置熒光生物顯微鏡系統:本實驗中所配置的OLYMPUS正置陽光生物顯微鏡可以很好地完成明場和暗場顯微鏡觀察，具有良好的可靠性、穩定性和實驗室廣泛應用等特性。顯微鏡數碼照相部分所配置的數碼照相機，為專業應用的高清晰度數碼相機，采用不同于民用的數碼數據采集及系統，此款相機的成像最高可達到1200萬像素級別，并且在使用明場拍攝的同時可以可靠、穩定地完成熒光圖像、暗場等特殊拍攝的要求，對實驗圖像數據的記錄、再現和分析提供了很好的可能和保障；該相機的相關系統是目前應用比較普通、性能比較優越的；如出現問題也方便維修和更換配件。配備微機及色彩打印系統效果最佳。

• “EPA1623方法”所需部分產品信息